DNA的复制

DNA（脱氧核糖核酸，Deoxyribo Nucleic Acid）是生物体内的主要遗传物质，在遗传信息的传递中有相当重要的作用。在细胞内，DNA存在于细胞核内以及线粒体和叶绿体内。在真核细胞的有丝分裂，减数第一次分裂以及原核生物二分裂间期，细胞将进行DNA复制，保证在子细胞内有足量的DNA进行遗传信息的传递以及蛋白质的合成等多种生物化学反应。每一个细胞中的完整的基因组就是DNA复制最终产生的结果。由于DNA通过氢键进行碱基互补配对产生双链，所以只需要一条核酸链就可以确定双链DNA的碱基序列，即DNA分子的每一条链都含有其互补链的所有信息。 对于DNA的复制，有多种猜测，DNA双螺旋结构提出者Watson和Crick推测在复制过程中，双链先解开螺旋，之后每一条链作为模板进行分布合成，因此，子代分子的一条链来自亲代，另一条链来自复制，这种方式称为DNA的半保留复制。半保留复制的首次证明由Meselson和Stahl于1958年通过放射性同位素标记法首次完成。通过用¹⁵N标记的物质作为氮源对大肠杆菌（此代大肠杆菌标记为P，后续按照繁殖顺序依次标记为F₁，F₂等等）进行放射性标记培养，得到¹⁵N-DNA。之后用普通培养基（¹⁴N）对其进行培养，并且将后续培养获得的大肠杆菌进行离心分离DNA成分，最终得到的大肠杆菌中，F₁的DNA通过离心分离得到的DNA中，全部位于中带，而F₂中，有一半位于中带，一半位于轻带，从此开始，位于中带的DNA分布逐渐减少，但是始终有一部分位于中带中。这种现象说明，在复制过程中DNA分子可以被分成两个亚单位，分别构成DNA分子的一半，在复制后，这些亚单位始终能够保持完整性。

DNA复制的相关概念

复制子与复制叉

在DNA复制过程中能够进行独立复制的单位称为复制子，在进行复制过程中，每一个复制子都有独立的起点和终点。即在复制起点和终点之间的结构称为复制子。每个复制子含有一个复制起始点，复制叉从起始点开始进行移动，并且可以单向复制（一个复制叉）或者双向复制（两个复制叉）。双向复制过程中，两个复制叉复制的速度相等，从起点开始朝相反方向进行。

复制起始点

复制起始点中含有较为丰富的AT序列，这种序列有利于DNA双链的解开。通常情况下，原核生物，病毒和线粒体中的DNA只有一个复制起始点，即作为单个复制子完成复制，而真核细胞基因组通常有多个复制起始点进行复制。在一般情况下，某特定时间范围内只有不超过15%复制子在进行复制。

复制终止点

复制子中控制复制终止的位点称为复制终止点。环形的大肠杆菌DNA中，复制终止点的位置在起始点的相对位置（旋转180°），起始点形成两个复制叉，最终到达终点时两个复制叉相遇，停止复制。

复制方向

复制过程中可以使用放射性同位素自显影方式进行复制方向的判断，通常情况下使用³H进行判断

单向复制

从一个起始点开始只有一个复制叉进行移动，通常在环状DNA中以这种方式进行复制。

双向复制

通常在一个起始点向这个起始点的两侧同时形成复制叉，在所有生物中DNA复制主要是在固定起始点通过这种方式进行复制，复制的两个方向复制速率相等。

相向复制

从两个起始点开始以两条链作为模板进行复制，形成两个复制叉的生长端，但是每一个复制叉中只有一条链进行复制作为模板。部分线性DNA病毒以这种方式进行复制。

复制速率

通常情况下，真核细胞复制过程中速率约为1kb~3kb/min，有多个起始点可以同时进行复制；原核细胞中只有一个复制起始点，但是复制速率可达50kb/min。每个复制单位能够在30~60min内完成复制且起始点可以连续启动复制满足生长需求。

冈崎片段与半不连续复制

DNA的反向平行结构决定了在复制过程中的特殊性，由于DNA复制只能从依据DNA聚合酶的5'→3'的方向进行，这种原理无法解释DNA两条链几乎同时完成合成的事实。日本学者冈崎令治，冈崎恒子等提出了DNA半不连续复制模型和冈崎片段的假说。 DNA半不连续复制模型认为，在DNA进行复制过程中，满足DNA聚合酶合成方向的子代DNA链会随着亲代DNA的展开而连续复制，而原始序列不满足DNA聚合酶合成方向的片段会先根据其方向（5'→3'）形成大量不连续的片段，之后再由DNA连接酶连接合成。这种复制过程称为DNA的半不连续复制，先连续复制的DNA链被称为先导链，后进行复制的链称为后随链，后随链在形成完整DNA链之前的片段被称为冈崎片段。

DNA聚合酶的作用机制

DNA聚合酶用一个活性位点催化4种脱氧核苷酸的正确添加，通过监视引入核苷酸形成碱基对的能力，在正确碱基形成的情况下，引物的3'-OH才能与在最佳催化位置上的NTP中的α-磷酸基发生反应。在该酶的催化作用下，正确的碱基掺入速率为错误碱基掺入速率的一万倍，体现了酶对不同底物的催化选择性。

DNA聚合酶的三个结构域

该酶的结构类似半握的右手，三个结构域分别被称为拇指，手指和手掌。结合时，DNA位于手掌中，DNA催化位点位于手指和拇指之间的裂缝中。手掌由β-折叠构成，由Mg²⁺结合调节相应结构域周围的化学环境，便于进行催化反应。手掌结构域能够进行碱基配对检查，错误配对的碱基对将被剪切进行重新结合反应。手指结构域能够引与引入的dNTP结合，正确的dNTP结合之后手指结构域能够包裹dNTP，引入的核苷酸与金属离子紧密接触，促进催化反应。手指区域与模板区的紧密结合能够让模板产生弯曲，避免在引入新核苷酸时发生混淆。若在复制过程中产生错误配对，相应酶的催化效率会显著降低，且会导致底物脱落，重新结合到具有催化效能的活性位点上。结构中的拇指区能够与新合成的DNA相互作用，一个是维持引物以及活性部位的正确位置，另一个是促进DNA聚合酶与底物之间的紧密连接，以便添加更多dNTP。

DNA聚合酶的延伸能力

DNA合成速率由DNA聚合酶的延伸能力决定，即每次聚合酶与模板-底物复合物结合时添加核苷酸的平均数。高延伸性能的DNA聚合酶可达低性能聚合酶聚合速率的1000倍甚至更多。DNA聚合酶与相关蛋白质以及模板形成的结构类似一种滑动夹，而这种滑动夹能够极高程度地提高DNA聚合酶聚合能力。

DNA复制的特点

原核生物DNA复制的特点

DNA双螺旋解旋

解旋形成复制叉的过程需要多种蛋白质参与反应，其中有酶，DNA结合蛋白以及其他功能性蛋白。除酶与Dna蛋白之外，还有SSB蛋白（单链结合蛋白）来稳定解开后形成的单链DNA保证不会迅速恢复成双链结构影响后续过程的复制。下列说明具体蛋白质对解旋的重要作用。

DNA解链酶（DNA helicase）

DNA解链酶具有ATP水解酶活性，除Rep蛋白之外的所有DNA解链酶都是从模板链的5'到3'端进行移动解链的。由此可推测Rep蛋白的作用是在母链上进行协同作用，共同解开DNA双链结构形成单链。

单链结合蛋白（SSB）

最初发现噬菌体T4的基因32蛋白可以在远低于解链温度的情况下解开DNA双链，并进行紧密结合，后续在许多生物体内都发现相似蛋白质，且原核生物中的SSB具有协同效应。SSB在复制叉处以四聚体形式存在，单链复制结束后结束四聚体形态，离开复制叉，重新进入循环。单链状态有利于DNA聚合酶结合，保证在复制结束之前保证稳定性，进行连续复制。

DNA拓扑异构酶

天然DNA具有一定的负超螺旋结构，可以形成一定的单链便于与蛋白质结合。复制过程中随着解旋，双螺旋盘绕数T减少，超螺旋数W增加，使正超螺旋增加，未解链部分缠绕更加紧密，导致后续更难解旋。拓扑异构酶能够消除正超螺旋堆积，让后续解旋更加容易进行。

DNA复制的引发

新DNA链的合成需要RNA作为引物（带有游离3'羟基）。复制起始过程中，先由引发酶（特殊RNA聚合酶，可以在无DNA序列引导的状态下合成新的RNA分子）合成RNA作为引物，之后再由DNA聚合酶在RNA引物基础上合成新的DNA分子。无论是前导链还是后随链的合成都需要RNA作为引物进行引发，且在后随链合成过程中，每一个冈崎片段都需要一个引物进行引发，通常后随链引发过程由引发体进行。引发体由6中蛋白质n,n',n,DnaB,DnaC和DnaI组成，但最终发挥作用的是这六个蛋白质组成的组合体。引发体在后随链上前进，并且将断续引发引物RNA短链，直到遇到下一个引物或者冈崎片段。RNaseH将降解RNA引物且由DNA聚合酶I将缺口补齐，之后将由DNA连接酶将冈崎片段连接起来形成完整DNA分子。

DNA复制的延伸

复制延伸中，前导链和后随链合成同时进行，前导链持续合成，由全异二聚体中一个亚单位与前导链模板结合，在RNA引物基础上，连续合成新的DNA，合成方向与复制叉相同。后随链分段合成，先产生冈崎片段，最终连接合成完整DNA链。后随链合成分为4个步骤： ①引物酶先合成约10个核苷酸大小的引物，引物间距在细菌中约1~2k个核苷酸，真核生物中约100~400个核苷酸； ②DNA聚合酶III按照既定方向进行延伸，直到遇到相邻引物的5'端，形成的这个片段即冈崎片段； ③E.coli中DNA聚合酶I具有5'到3'外切酶活性，用于去除引物； ④DNA连接酶将各冈崎片段连接形成完整DNA链。

复制的终止

复制的终止主要依靠Tus蛋白，复制叉前移过程中，在22bp重复性终止子序列Ter-Tus复合物能够停止DnaB解链，阻挡复制叉前移，在相反方向的复制叉到达停止后，中间仍有50~100bp未完成复制，这些未完成复制的部分通常由DNA修复机制进行修复。最终在拓扑异构酶的作用下，复制叉解体，释放DNA子代链。

DNA聚合酶

细胞中含有多种被特化DNA聚合酶，能够进行高效精准地DNA复制。大肠杆菌中现在发现有5种DNA聚合酶，分别是DNA聚合酶I,II,III,IV,V，不同的DNA聚合酶行使不同的功能。

DNA聚合酶I

DNA聚合酶I是第一个被鉴定的DNA聚合酶，是一个蛋白质，可被蛋白酶切割成两个部位。C端区域（又称Klenow片段）占酶的2/3,主要活性是DNA聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性，能够合成以及降解DNA，保证DNA合成过程中的准确性。其N端区域具有5'→3'外切核酸酶活性，可作用于双链DNA，也可水解5'端以及距离5'端几个核苷酸的磷酸二酯键，被认为在切除因为紫外线照射形成的嘧啶二聚体中有重要作用。在冈崎片段修饰过程中，也可以对冈崎片段的5'引物进行切割，使缺口消失便于进行连接。

DNA聚合酶II

具有5'→3'方向聚合酶活性，但是相对较低。按照每分钟掺入的核苷酸数目计算，只有DNA聚合酶I的5%。其中3'→5'外切酶活性可以进行校正作用，目前被认为是进行DNA修复作用。

DNA聚合酶III

包括9个7种亚基，生物活性形式是二聚体，同时具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性。其活性是DNA聚合酶I的15倍，是DNA聚合酶II的300倍。高活性让其成为大肠杆菌DNA合成过程的主导酶，是组成具有高合成活性的DNA聚合酶III全酶的重要组成部分。其在引物3'端的合成速率约为每分钟5万个核苷酸。

DNA聚合酶IV和DNA聚合酶V

由dinB基因和umuD'₂C基因编码，主要作用是在DNA修复和跨损伤合成过程中起到重要作用。

原核生物DNA复制的调控

原核细胞生长增殖的速率主要取决于培养条件，但是在不同分裂速度的细胞中，DNA合成的速率基本上是恒定的，只是复制叉数量不同。原核细胞中，DNA复制起始不依赖细胞分裂但是复制终止能够引发细胞分裂。在一定范围内，细胞与染色体质量比相对恒定，这种关系由多种物质进行制约。复制功能单位即复制子与转录的操纵子相似，由起始物位点和复制起始点两部分构成。起始物位点编码复制调节蛋白质，复制起始点与调节蛋白质相互作用启动复制。起始物位点突变导致复制停止并且引发细胞死亡。DNA复制调控主要发生在起始阶段，一旦开始复制之后如果没有意外阻力即可一直进行直到完成。

真核细胞DNA复制特点

真核细胞DNA复制过程和原核细胞DNA复制过程由相同点但是有相当多区别，这是真核生物和原核生物基因导致的差异。

真核生物DNA每个细胞周期只复制一次

DNA复制只是真核生物细胞周期一部分，在且仅在S期进行。第一批复制子的启动标志着S期开始，之后相继启动其他复制子，进行复制。在S期内所有DNA都需要完成一次精准的复制，重复复制或者不完全复制会导致严重的后果。由于复制速率相对比较慢，所以需要较多的复制子进行复制。

真核生物复制起始须前复制复合体pre-RC指导

原核生物中，代表性的是酿酒酵母，其复制需要特殊起始点，长度约150bp，包括数个复制起始必须的保守区，这些特殊区域作为一个部件构成一个环状DNA分子，该核外DNA分子在细胞内能够自主复制。该起始点称为自主复制序列（autonomously replicating sequences,ARS），在其他真核生物中也陆续发现类似序列。 真核生物中复制其实的两个步骤发生在细胞周期的不同时期，对知道复制其实的序列进行是识别在G₁期，随后进入S期；4个独立蛋白质组成的前复制复合体的形成介导复制器的选择。真核细胞DNA复制的其实需要起始点识别复合物参与。

细胞周期蛋白依赖性激酶调控前复制复合体的形成与激活

ORC结合复制器后，招募两个解旋酶装载蛋白Cdc6和Cdt1，再共同招募真核复制叉解旋酶Mcm2~7复合体形成pre-PC。pre-PC在真核细胞中的激活需要在S期由Cdk和Ddk进行激活，而pre-PC被磷酸化之后诱发起始点上其他复制蛋白的组装和复制开始。细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk在G₁期无活性，在S，₂和M期有较高活性。Cdk对pre-RC有双重调节功能，在对其进行激活之后能够阻止新pre-RC形成。

真核生物DNA聚合酶

真核生物中有超过15种DNA聚合酶，哺乳动物细胞中主要是5种，分别是α，β，γ，δ和ε。真核细胞DNA聚合酶性质与细菌细胞DNA聚合酶性质基本相同，底物均为dNTP，激活剂均为Mg₂₊,在进行合成过程中均需要模板以及相应引物，合成方向均为5'→3'。真核细胞中DNA聚合酶均无外切活性，故有其他酶进行修正剪切。

DNA聚合酶α

该酶主要功能是引发引物合成，即前导链和后随链的起始，与引发酶形成复合体，具有引发和延伸的双重作用，又被称为pol α的引发酶。

DNA聚合酶β

活性水平稳定，主要是在DNA损伤修复中起到作用，是高忠实性修复酶。

DNA聚合酶δ

参加前导链和后随链的合成。

DNA聚合酶ε

作用于合成过程中核苷切除和碱基切除修复中。

端粒酶与DNA末端复制

DNA复制启动需要引物作为引导支持，在线性染色体末端DNA进行复制过程中会出现问题。后随链的复制需要多条引物，当最后一个冈崎片段合成的容纳引物末端与后随链模板上末端碱基对退火，RNA引物被从DNA-RNA杂交双链上去除后，引物酶可能缺乏足够的空间合成新RNA引物，导致后随链DNA产物3'端形成小段单链DNA，导致每次复制之后都有DNA被截短，这种形式被称为端粒。 细胞主要通过两种方式解决端粒问题，一种方式是用蛋白质代替RNA作为冈崎片段引物，另一种方式是利用端粒酶进行端粒延伸，从根本上解决端粒复制问题。端粒酶是蛋白质和RNA复合物，不需要外援DNA分子指导新dNTP添加。RNA序列中含有1.5拷贝的完整端粒序列，可以与端粒3'端退火，利用自身RNA成分作为模板将端粒序列添加到染色体3'端，同时与端粒双链结合的蛋白质会精确控制该片段长度，不会导致无限延伸。

真核细胞DNA复制调控

细胞水平调控

也称限制点调控，即决定细胞停留在G₁期或者是进入S期。许多外部因子会参与限制点调控，促细胞分裂剂，致癌物质，外科切除都能导致细胞从G₁期进入S期，部分细胞因子如四磷酸二腺苷和聚ADP-核糖也会诱导DNA复制。

染色体水平调控

决定不同染色体或者染色体不同部分在不同时间段依次复制，机制尚未明确。

复制子水平调控

复制子水平调控决定是否开始复制，在不同生物之间高度保守（即：在不同生物之间具有高度相似性）。

参考文献：朱玉贤《现代分子生物学》第五版，朱玉贤，李毅，郑晓峰，郭红卫